該研究開發(fā)了一種凝聚作用觸發(fā)的成型方法，使重組人膠原蛋白（RHC）和單寧酸（TA）能夠進行分層組裝，該方法制備的水凝膠具有作為手術密封材料的多種優(yōu)良性能，包括快速凝膠時間(<10s)、凝血時間(<60s)、超拉伸性(應變>10000%)、強粘附力(粘附強度>250 kPa)。最后成功應用于心臟和肝臟組織的牢固粘附和密封之用。這項工作為生物醫(yī)學應用提供了一種在潮濕和動態(tài)生物環(huán)境中極具前景的水凝膠基外科密封劑。

該實驗研究中采用的重組膠原蛋白（以下簡稱RHC）由江蘇江山聚源生物技術有限公司研發(fā)生產，由楊洋博士提供給本研究項目組。

研究背景

粘附性水凝膠作為組織粘合劑、外科密封劑和止血材料具有巨大的應用潛力。然而，開發(fā)能夠在潮濕、動態(tài)的生物組織上快速可控發(fā)揮粘附作用的水凝膠材料是一個巨大的挑戰(zhàn)。因此，研發(fā)一種能改善水凝膠的濕粘附和即時止血性能，以及可塑、可成形和自愈合能力的水凝膠至關重要。

研究成果

在這項研究中，模擬了天然材料的凝聚過程和分層組裝結構，通過引入RHC和TA分子，首次開發(fā)了一種非常有前途的水凝膠基手術密封膠。通過調節(jié)二者凝聚過程的參數，RHC和TA組裝體的構象從顆粒狀聚集體演變?yōu)榫W狀聚集體（松散）和網狀聚集體（致密），伴隨著機械和粘附性能的顯著增強。由此得到的分層結構水凝膠顯示出了幾個關鍵特征，滿足潛在的手術密封膠的要求：(1)易于加工和操作，(2)快速的凝膠和止血能力，(3)強大的機械和堅韌的粘附性能，(4)超拉伸和自愈合能力，(5)良好的生物相容性。由于上述特性，水凝膠成功地應用于原位切口部位，并迅速凝聚，以在潮濕和動態(tài)的生物環(huán)境中實現強大的粘附。此外，RHC和TA本身都具有良好的生物相容性，且不需要額外的引發(fā)劑或交聯劑。

本研究提出了一種很有前景的手術密封膠，可廣泛應用于手術體內生物組織的粘膠，為水凝膠結構設計提供了科學和應用依據，以促進高性能生物材料的先進制造。

圖1 基于RHC和TA制備快速交聯、高粘附、超拉伸和止血水凝膠的設計策略。(a)分子建模中RHC和TA的代表性結構。(b)基于RHC和TA之間物理相互作用的大分子組裝到層次塑造的示意圖。(c)水凝膠作為手術密封膠的不同特征。

圖2 基于分子動力學模擬的RHC與TA之間的潛在相互作用。(a)從分子建模中獲得的RHC和TA的代表性結構及其相應的表面顯示結果。(b)RHC與TA相互作用過程中空間構象變化的分子動力學模擬。(c)TA分子與RHC蛋白氨基酸之間氫鍵相互作用的模擬模型。黃色的虛線：氫鍵。(d)RHC和TA的結合能隨模擬時間的變化。透瓊斯勢(LJ勢）、靜電勢能（庫侖勢）。(e)RHC和TA之間的質心距離作為模擬時間的函數。(f)RHC的均方根偏差（RMSD）作為模擬時間的函數。

圖3 不同成分的RHC與TA之間的凝聚相互作用。(a)不同組成的水凝膠前驅體的光學圖像、(b) SEM圖像、(c)紫外-可見光譜、(d) FTIR光譜。

圖4  RHC-TA水凝膠的合成與表征。(a)RHC溶液（20% w/v）、TA溶液（40% w/v）及其混合物的光學圖像變成了略黃色的水凝膠。(b)在RHC和TA之間不同濃度下的水凝膠形成示意圖。(c)不同的水凝膠形成階段，從液體、顆粒狀聚集物到網狀聚集物。(d)不同水凝膠形成階段的光學和熒光圖像。比例尺：400μm。

圖6  RHC-TA水凝膠的力學表征。(a)照片顯示了RHC-TA水凝膠的超拉伸性。直徑分別為500、300和150μm的直絲的(b)掃描電鏡圖像。用RHC-TA水凝膠制作的不同螺旋形細絲的掃描電鏡圖像。比例尺：400μm。(c)描述RHC-TA水凝膠的交聯和超拉伸機理的示意圖。(d)拉伸應力-應變曲線和(e)不同RHC濃度從5%、10%、15%到20%（w/v）的水凝膠的壓縮應力-應變曲線）（TA濃度：40% w/v)的曲線。

圖7  RHC-TA水凝膠的粘附性和凝血性能。(a)貽貝產生由大量可伸縮的囊線組成的粘附囊。囊狀線的光學和熒光圖像。(b)圖像顯示了RHC-TA水凝膠的原位合成過程和表征。(c)圖像顯示了RHC-TA水凝膠對自然組織的粘附行為。(d)使用豬皮膚組織表面進行的搭接剪切試驗示意圖。(e)不同RHC濃度為5%、10%、15%到20%（w/v）的RHC-TA水凝膠的代表性粘附應力置換曲線（TA濃度：40% w/v）。(f)水凝膠的粘合劑強度。(g)用RHC（20% w/v）和不同TA濃度（5%、10%、20%、40% w/v）產生的RHC-TA水凝膠進行凝血形成隨時間的平板測定。(h)用不同TA濃度的RHC（20% w/v）產生的RHC-TA水凝膠的定量凝血時間(**p < 0.01).

圖8  Ta介導的粘聚和粘附相互作用的反應化學示意圖。內聚過程是由分子間的相互作用驅動的，特別是RHC和TA之間的氫鍵。粘附過程得益于TA與親核試劑的強結合親和力。組織表面的酰胺、胺和硫醇)。

圖10。RHC-TA水凝膠的生物相容性。(a)成纖維細胞（MRC-5細胞）在RHC-TA水凝膠上培養(yǎng)1、3和7d后的活/死染色的熒光圖像。比例尺：300μm。在水凝膠上培養(yǎng)7d的(b) F-actin/DAPI染色圖像。比例尺：300μm。(c)在RHC-TA水凝膠上培養(yǎng)1、3和7d后，定量測定細胞活力。(d)不同天數細胞增殖比較(**p < 0.01).

圖11。將粘合劑RHC-TA水凝膠作為手術密封膠在大鼠心臟出血模型中的體內評價。(a)在大鼠心臟出血模型中，RHC-TA水凝膠的止血能力示意圖。(b)立即原位形成RHC-TA水凝膠治療心臟損傷的大體圖。箭頭和圓圈分別表示出血部位和經水凝膠處理的部位。(c)移植后7天，RHC-TA水凝膠附著在心臟組織表面的蘇木精/伊紅染色圖像。比例尺：1200μm。(d)對RHC-TA水凝膠與心臟組織表面之間的粘附區(qū)域的放大視圖。比例尺：300μm。(e)RHC-TA水凝膠在大鼠心臟組織表面的粘附強度。(f) RHC-TA水凝膠顯著提高了介入治療后的生存率。(g)移植后7天對RHC-TA水凝膠的免疫染色分析。比例尺：300μm。切片用CD3或CD68抗原染色，用DAPI反染。紅色代表免疫細胞，藍色代表細胞核（DAPI）。

研究意義 

本研究通過聯合應用RHC和TA，開發(fā)能夠在潮濕、動態(tài)的生物組織上快速可控發(fā)揮粘附作用的水凝膠材料，顯著提高了機械性能和粘附性能。

聚源生物的重組人源化膠原蛋白（RHC）憑借多年精益鉆研重組膠原蛋白的合成生物學應用，有效解決了傳統(tǒng)動物膠原的親水性差、免疫排斥等問題，且產品高活性和高純度等優(yōu)勢，在醫(yī)藥、化妝品、食品等眾多領域均得到很好的的結合，真正讓重組膠原蛋白從實驗室走向應用，讓科技為人所用。

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